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Fluoreszenzmikroskopie

Begriffe

Die Fähigkeit eines Körpers zu leuchten, wenn er von einer Lichtquelle angestrahlt wird, bezeichnet man allgemein als Lumineszenz.

Dabei werden zwei Fälle unterschieden:

  • Phosphoreszenz: Das Leuchten des Körpers hält an, auch wenn er nicht mehr angestrahlt wird. Es klingt u.U. langsam ab.

  • Fluoreszenz: Leuchterscheinung und Anstrahlung sind streng gekoppelt. Wird der Körper nicht mehr angestrahlt, so schwindet auch die Leuchterscheinung.
Der Ausdruck Fluoreszenz stammt von Flußspat (Fluorit) her, der diese Fluoreszenz zeigt. Die Fluoreszenz ist ein monomolekularer Vorgang, der durch Auswahlregeln und Übergangswahrscheinlichkeiten bestimmt wird. Ihre Intensität fällt nach dem Ende der Anregung (z.B. Beleuchtung) exponentiell ab. Selbst bei starker Anregung tritt keine Sättigung ein.

Die Fluoreszenz gehorcht normalerweise der Stokesschen Regel: diese besagt, daß ein gewisser Teil der eingestrahlten Lichtenergie nicht als Licht zurückgestrahlt wird, sondern z.B. als Wärme abgegeben wird. Daher wird das angeregte Licht normalerweise langwelliger (energieärmer) als das anregende Licht.

Als energiereiche Lichtquelle werden meistens aufwendige Lampenhäuser mit Quecksilberhöchstdruckdampflampen eingesetzt. Diese Lampen sind sehr empflindlich und haben eine ziemlich kurze Lebensdauer. Für Schulungs- und Ausbildungszwecke kann diese aufwendige Beleuchtung auch durch eine geeignete Leuchtdiode ersetzt werden. Da diese Leuchtdiode passend zur benötigten Anregungsfrequenz ausgewählt werden kann, ergeben sich konstruktive Möglichkeiten, den Filterblock einfacher und somit auch preiswerter zu gestalten und darüberhinaus auf das aufwendige Lampenhaus mit der problematischen Quecksilberhöchstdruckdampflampe zu verzichten.

Nachfolgend soll lediglich die Fluoreszenz näher betrachtet werden mit ihrer Anwendung in der Mikroskopie.

Physikalische Grundlagen

Wird ein Präparat mit Licht bestrahlt - wird es beleuchtet - so wird ihm Lichtenergie zugeführt. Diese Lichtenergie kann entweder von den Atomen oder Molekülen des Präparates selbst absorbiert werden oder von den Atomen oder Molekülen eines Farbstoffes, mit dem das Präparat vorher eingefärbt wurde.

Diese zugeführte Energie versetzt die jeweilige Substanz in einen energetisch höheren Zustand, wobei die Lichtenergie in andere Energieformen umgewandelt werden kann, z.B. in Schwingungsenergie (Schwingen von Atomen und Molekülen um ihre Gleichgewichtslage), Rotationsenergie (Rotieren eines Moleküls um seinen Schwerpunkt) und Anregungsenergie (Elektronen der Atome und Moleküle werden in einen "angeregten" Zustand gebracht).

Der energieärmste Zustand ist normalerweise der stabilste Zustand, und so versucht eine Substanz nach Energiezufuhr, diesen stabilen Grundzustand wieder einzunehmen, d.h. die überschüssige Energie abzugeben. Für die angeregten Elektronen bedeutet dies, daß sie nach kürzester Zeit (10-5 sec bis 10-8 sec) ihren Grundzustand wieder einnehmen, wobei die überschüssige Energie in Form von
  • Wärme
  • chemischer Energie (dies kann zur Zerstörung oder Umwandlung des Stoffes führen)
  • elektromagnetischer Energie (z.B. Licht)
abgegeben werden kann.

Die Abgabe der Energie in Form von Licht ist die Basis der Fluoreszenzmikroskopie. Das Präparat wird mit Licht bestrahlt und gibt wiederum Licht ab, so lange es bestrahlt wird.

Manche Stoffe (z.B. Chlorophyll, Öle, optische Aufheller) fluoreszieren ohne jede Vorbehandlung. Man spricht dann von Eigen-, Auto- oder Primärfluoreszenz.

In den meisten Fällen jedoch (z.B. Zellen, Gewebe, Bakterien) muß ein Präparat vorbehandelt werden, d.h. es wird mit Materialien angefärbt, die charakteristische Fluoreszenzfarben erzeugen. Solche Farbstoffe heißen Fluorochrome. Die von ihnen hervorgerufene Fluoreszenz heißt Sekundärfluoreszenz. Von ihr wird üblicherweise in der Mikroskopie gesprochen, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes gemeint ist.

Die Energie des Lichtes ist von seiner Frequenz abhängig. Dabei besteht folgender Zusammenhang:

E = h * f (1)

E = Energie des Lichtes
h ist eine Konstante (Plancksches Wirkungsquantum (6,626196 ± 0,000050) * 10-34 J * s)

oder wegen c = f * λ

f = Frequenz (Zahl der Schwingungen pro Sekunde)
c = Geschwindigkeit des Lichtes
λ= Wellenlänge des Lichtes


h * c
E = ---------------- (2)
λ

Das heißt in Worten:

Je größer die Frequenz, desto größer die Energie (1)

oder

Je kleiner die Wellenlänge, desto größer die Energie (2)

Blaues Licht hat im sichtbaren Spektrum die größte Frequenz und damit die größte Energie - und die kleinste Wellenlänge.

Rotes Licht hat die kleinste Frequenz und damit die geringste Energie - und die größte Wellenlänge.

In biologisch/medizinischen Präparaten wird die eingestrahlte Energie nicht ausschließlich wieder in Form von Licht abgegeben, sondern ein Teil wird auch in Form von Wärme zurückbehalten. Das hat zur Folge, daß das abgegebene Licht weniger Energie hat als das eingestrahlte (Stokessche Regel).

Damit ergibt sich folgende Übersicht über Begriffe/Zusammenhänge:

Lichtanregung Lichtabgabe
-------------------------------------------------------------
Excitation Emission
Anregungslicht Fluoreszenzlicht
Eingestrahlte Energie > abgegebene Energie
Anregungswellenlänge < Fluoreszenzwellenlänge
Excitationswellenlänge < Emissionswellenlänge


Fluoreszenzmikroskopie

In der gebräuchlichen Hellfeldmikroskopie werden Präparate durch Lichtabsorption (Färbung) bzw. durch abgebeugtes Licht (Phasenkontrast, Dunkelfeld) dem menschlichen Auge differenziert dargestellt. Das Gesichtsfeld erscheint in der Durchlicht-Hellfeld-Betrachtung hell, die Objektstrukturen heben sich farbig bzw. hell/dunkel von ihrer Umgebung ab.

Im Fluoreszenzmikroskop sieht dies ganz anders aus. Der gesamte Bilduntergrund erscheint grundsätzlich dunkel, und nur die Stellen, an denen fluoreszierende Substanzen/Strukturen vorliegen, leuchten in ihren typischen Fluoreszenzfarben auf.

Das hat gerade in der medizinischen Diagnostik erheblich Vorteile. Falls z.B ein Stoff (etwa eine bestimmte DNA-Sequenz als Ursache für eine Erbkrankheit), nach dem gefahndet wird, vorhanden ist, leuchtet er auf, falls nicht, bleibt das Gesichtsfeld dunkel. Die Frage nach seinem Vorhandensein kann also nur mit Ja / Nein beantwortet werden, ein "Jein" scheidet aus.

Weitere Vorteile sind:
  • hohe Nachweisempfindlichkeit
  • hohe Spezifität

Als Nachteile sind zu werten:
  • Fading (Abklingen der Fluoreszenzintensität).
  • unspezifische Eigenfluoreszenz.
  • Standardisierung der Färbetechniken.


Auflichtfluoreszenz

Grundsätzlich kann Fluoreszenz sowohl im Auflicht als auch im Durchlicht angewandt werden. Die Auflichtfluoreszenzmikroskopie hat jedoch im Vergleich zur Durchlichtfluoreszenz einige Vorteile.

Die nachfolgende Schemazeichnung zeigt den grundsätzlichen Aufbau einer Auflichtfluoreszenzeinrichtung.



Anregungsfilter

Das erste Filter nach der Lichtquelle ist das Anregungsfilter, das aus dem gesamten Wellenlängenspektrum der Lampe den Bereich auswählen soll, der zur Anregung des gewählten Fluorochroms erforderlich ist.

Dichromatischer Teilerspiegel

Dem Teilerspiegel fällt in der Auflichtfluoreszenzmikroskopie eine besondere Aufgabe zu. Er muß das Anregungslicht möglichst vollständig zum Präparat hin reflektieren, während das Fluoreszenzlicht vollst„ndig durchgelassen werden soll. Filter mit solchen Eigenschaften werden auch als Reflexions-Kurzpaßfilter bezeichnet oder als dichromatische Teilerspiegel.

Da von dem dichromatischen Teilerspiegel bestimmte Bereiche eines Spektrums voll reflektiert werden, während andere voll durchgelassen werden, ist es möglich, das Anregungslicht vom Fluoreszenzlicht exakt zu trennen.

Sperrfilter

Das Sperrfilter ist im Abbildungsstrahlengang untergebracht und soll nur den Wellenlängenbereich hindurchlassen, der spezifisch für das verwendete Fluorochrom ist. Damit soll alles andere Fluoreszenzlicht oder gar das vom Präparat reflektierte Anregungslicht vom Beobachter ferngehalten werden.

Anregungsfilter, dichromatischer Teiler und Sperrfilter müssen für ein Fluorochrom genau aufeinander abgestimmt sein, wenn optimale Ergebnisse erzielt werden sollen.

Beispiel: Filterblock FITC

Anregungsfilter: Bandpassfilter 450 nm - 490 nm

Dichromatischer Teiler: Refelexionskurzpaßfilter 510 nm

Sperrfilter Langpassfilter: ab 520 nm



Mikroskop-Optik


Objektive

Ziel ist es stets, helle Fluoreszenzbilder zu erhalten. Hierfür eignen sich besonders hochaperturige Objektive. Die Apertur eines Objektivs bestimmt im wesentlichen sein Auflösungsvermögen.

Hochaperturige Objektive sammeln im Durchlicht viel vom Präparat ausgehendes Licht - im Auflicht konzentrieren sie viel Erregerlicht auf das Präparat und ergeben somit bessere Fluoreszenzbilder als niederaperturige Objektive.

Die Helligkeit des Fluoreszenzbildes ist proportional zur vierten Potenz der Objektivapertur.

Schwächere Vergrößerungen ergeben ebenfalls hellere Bilder.

Somit gilt folgende Faustregel:
  • Helle Fluoreszenzbilder erzielt man mit schwacher Vergrößerung und hoher Apertur.
  • In der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzte Objektive müssen vor allem UV-Licht und blaues Licht durchlassen und dürfen nur aus solchen Gläsern bestehen, die keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
  • Auch Immersionsöl darf keine Eigenfluoreszenz zeigen. Wird größter Wert auf Fluoreszenzfreiheit gelegt, so empfiehlt sich Paraffinöl.
  • Geringe Eigenfluoreszenz kann im Routinebetrieb normalerweise toleriert werden.
  • Luftblasen im Immersionsmittel können zu erheblichen Störungen führen.

Okulare

Starke Okularvergrößerungen führen zu hohen Gesamtvergrößerungen und damit - wie aus der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie bekannt - zu lichtschwächeren Bildern. Dies gilt natürlich auch für die Fluoreszenzmikroskopie.
Es sollten daher immer Okulare mit möglichst kleiner Eigenvergrößerung gewählt werden.

Mikroskoptuben

Zum Erzielen möglichst heller Fluoreszenzbilder ist der Monokulartubus am geeignetsten. Üblicherweise wird jedoch der Binokulartubus verwendet, der im Normalfall keine Einschränkungen fordert. Bei fotografischen Aufnahmen oder bei der Adaption einer Videokamera wird normalerweise ein Binokulartubus mit Fotoausgang verwendet, bei dem 30 % des Lichtes zum Betrachter und 70 % zum Fotoausgang geführt werden. Hier empfiehlt sich immer ein umschaltbarer Tubus mit der Möglichkeit 100 % des Lichtes zum Auge bzw. zum Fotoausgang lenken zu können, um extrem lange Belichtungszeiten zu vermeiden.

Primäfluoreszenz des Chlorophylls

Einzellige Alge der Gattung Closterium mit zwei Chloroplasten,
links im Hellfeld, rechts im Fluoreszenzmikroskop






Einsatz im Bereich der Gewässerökologie

Bei entsprechender Ausstattung kann man im Fluoreszenzmikroskop einzellige Algen in einem Präparat wesentlich leichter auffinden, als dies in einem herkömmlichen Mikroskop für die Untersuchung im Hellfeld möglich wäre.


Flocke aus einem Gewässersediment

Im Hellfeld ist die Anwesenheit einzelliger Algen bestenfalls zu erahnen. In der Fluoreszenz fallen diese Organismen dagegen viel stärker durch die rote Fluoreszenz des Chlorophylls auf. Die zusätzliche gelbliche Fluoreszenz deutet auf cellulosehaltige Partikel pflanzlichen Ursprungs in der Flocke hin.








Hinweis: Es wird deutlich, dass einzellige Algen im Fluoreszenz-Mikroskop besonders deutlich auffallen. Für ökologische Untersuchungen in der Limnologie wird deshalb die Primärfluoreszenz von Chlorophyll häufig zur Bestimmung der Zellzahl kleiner einzelliger Algen ("autotrophes Picoplankton") genutzt. Man erhält dadurch wichtige Informationen zum Nährstoffhaushalt eines Gewässers.

Nähere Informationen zum Einsatz der Fluoreszenz-Mikroskopie in der Gewässeruntersuchung:

TÜMPLING, W.v., FRIEDRICH, G. (Hrsg.) (1999): Methoden der Biologischen Wasseruntersuchung 2 - Biologische Gewässeruntersuchung. G. Fischer, Stuttgart, New York.


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